近年来，二代建库测序技术的周期得到了显著提升，同时第二代短读长测序技术在市场上依旧占据着绝对优势。然而自2008年以来，第三代测序技术的发展势头也十分强劲。凭借其独特的长读长优势，第三代测序技术能够在不进行PCR扩增的情况下，直接对每一条DNA分子进行独立测序，广泛应用于基因组拼接、病原体研究和突变鉴定等诸多领域。

第三代测序的原理

第三代测序技术，也称为单分子DNA测序，通过现代光学、高分子和纳米技术等手段，能够区分碱基信号的差异，以实现直接读取序列信息。目前，市场上主流的第三代测序技术包括PacificBiosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术。这两种技术的最大特点是支持单分子测序，其中SMRT技术采用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子技术则利用不同碱基产生的电信号进行测序。

第三代测序的应用

目前，长读长测序的第三代测序平台已广泛应用于复杂动植物基因组、微生物基因组、全长转录组、微生物群体研究及人类基因组变异检测等科研领域，以解决上述领域中的技术瓶颈。在临床疾病检测方面，第三代测序技术具有独特优势，能够有效检测基因组结构变异、短串联重复/微卫星、甲基化等遗传病及肿瘤基因相关领域，如今基于第三代测序技术的遗传病基因诊断产品层出不穷。

第三代文库制备的DNA/RNA质量控制

DNA/RNA的质量会直接影响文库制备，选择不同的提取方法会导致样品中残留的化学试剂抑制酶的活性，同时DNA/RNA的完整性也会影响文库制备的效率，从而影响测序质量。为确保样品质量，需关注以下几个指标：纯度（应确保无RNA、DNA或蛋白质污染）、浓度（应不低于30ng/uL）、完整性（DNA平均片段大小应达到30kb，RNARIN需≥8），以及样品量（DNA需大于等于1μg）。建议使用TE缓冲液长期储存高分子量gDNA。

第三代文库制备的数据质量控制

与二代测序的基因质量标准Q20/Q30不同，第三代测序由于其随机分布的碱基错误率，单碱基的准确性无法直接用于衡量数据质量。最直接的判断方法是观察数据长度。通常，长度较短的测序数据不一定代表质量差，但质量差的数据长度通常较短。文库的构建是影响上游测序质量的关键因素，质量高的文库通常能够产生长度长且优质的数据。

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